Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С НАТРИЕМ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ (ДСН-ПАГ)
Отрасль применения. Электрофорез в полиакриламидном геле применяется для качественной идентификации белков в биологических препаратах, контроля их чистоты и количественных определений.
Цель. Аналитический гель-электрофорез - метод, позволяющий идентифицировать и оценить гомогенность белков в лекарственных средствах. Метод обычно используется для определения молекулярных масс белковых субъединиц и субъединичного состава очищенных белков.
На рынке имеется разнообразный ассортимент готовых к использованию гелей и реактивов, которые могут быть использованы вместо описанных в общей статье, если получаются эквивалентные результаты и выполняются условия раздела "Валидация испытания”, приведенного ниже.
СВОЙСТВА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
Ситовые свойства полиакриламидных гелей обусловлены тримерной сеткой геля, образующегося бифункциональным бисакриламидом, поперечно связанным (сшитым) с соседними акриламидными цепями. Процесс полимеризации катализируется свободно-радикалгенерирующей системой, образующейся с аммонием персульфатом и тетраметилэтилендиамином.
При увеличении концентрации акриламида в геле уменьшается эффективный размер пор. Эффективный размер пор геля оперативно определяется ситовыми свойствами, то есть, сопротивлением миграции макромолекул. Акриламид может использоваться только в определенных концентрациях. При высоких концентрациях акриламида гели чаще ломаются и являются сложными в обработке. Поскольку размер пор геля уменьшается, уменьшается скорость миграции белка через гель. Регулируя размер пор геля, изменяя концентрацию акриламида, можно оптимизировать условия разделения испытуемого белкового продукта. Следовательно, данный гель характеризуется содержанием и массовым соотношением акриламида и бисакриламида.
Кроме состава геля важным компонентом электрофоретической подвижности является структура белка. В случае определения белков, электрофоретическая подвижность зависит от значения рК заряженных групп и размера молекулы. На это влияют тип, концентрация и рН буфера, температура и сила электрического поля, а также природа материала носителя.
ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Данный метод является примером анализа мономерных полипептидов с молекулярной массой от 14000 дальтон до 100000 дальтон. Возможно расширение границ молекулярных масс (например, путем использования градиентных гелей, особенностей буферной системы), но такие методики анализа не обсуждаются в данной статье.
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием натрия додецилсульфата (ДСН-ПАГ; SDS-PAGE) является наиболее общепринятым методом электрофореза, который используется для оценки качества белковых лекарственных средств и описан ниже в качестве примера указанного метода.
Обычно аналитический электрофорез белков проводят в полиакриламидных гелях в условиях, обеспечивающих диссоциацию белков на отдельные полипептидные субъединицы, что минимизирует их агрегацию.Чаще всего перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации, нагревая их с сильным анионным детергентом
- ДСН. Денатурированные полипептиды связываются с ДСН, превращаясь в отрицательно заряженные частички с постоянным отношением массы к заряду, независимо от типа белка. Поскольку количество связанного ДСН почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от его последовательности, ДСН-полипептидные комплексы мигрируют в
полиакриламидном геле со скоростью, зависящей от размера полипептида.
Электрофоретическая подвижность полученных детергентполипептидных комплексов находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными массами. Миграция ДСН-комплексов происходит в направлении к аноду предположительно комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с высокомолекулярными массами. Следовательно, молекулярная масса белка может быть определена калибровкой ДСН-ПАГ, и наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.
Однако модификации полипептидной цепи, например, N- или О-гликозидными, приводят к значительной смене средней молекулярной массы белка, так как ДСН не связывается с карбогидратным компонентом так, как с полипептидным. В этом случае постоянное отношение заряда к молекулярной массе не сохраняется. Средняя молекулярная масса белков, подвергнутых посттрансляционной модификации, не является подлинным отображением массы полипептидной цепи.
ВОССТАНОВЛЕННЫЕ УСЛОВИЯ
Состав и тримерная структура белков часто поддерживаются присутствием дисульфидных связей. Целью ДСН-ПАГ испытаний в восстановленных условиях является разрушение структуры белка восстановлением дисульфидных связей. Полная денатурация и диссоциация белков обработкой 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (ДТТ) приводит к развертыванию полипептидной цепи и дальнейшему комплексообразованию с ДСН. В этих условиях молекулярную массу полипептидных субъединиц можно расчитать по линейной регрессии соответствующего стандарта молекулярных масс.
